Polymerase-Kettenreaktion - Wirkmechanismen, Anwendungsbereiche und Entwicklungsperspektiven

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine äußerst wichtige Methode in der modernen Molekularbiologie und Genetik. Es ermöglicht Ihnen, große Mengen spezifischer Kopien von Desoxyribonukleinsäure (DNA) unter Laborbedingungen zu erzeugen. Dieser Prozess ist für eine breite Palette wissenschaftlicher und angewandter Studien von entscheidender Bedeutung, wie genetische Analyse, Identifizierung von Mikroorganismen, Diagnose von Krankheiten und Forensics.

Das Wesen der PCR-Analyse besteht darin, die DNA abwechselnd zu erhitzen und zu kühlen, spezielle Komponenten hinzuzufügen und ein Enzym namens thermostabile DNA-Polymerase zu verwenden. Die Anfangsphase der PCR-Reaktion wird als Renaturierung bezeichnet - dieser Prozess besteht darin, zwei DNA-Ketten zu trennen, die durch Kopien eines genetischen Informationsmoleküls gekoppelt sind.

Die zweite Stufe ist das Glühen, bei dem ein Oligonukleotid verwendet wird, das es ermöglicht, ein Fragment eines spezifischen Gens zwischen zwei DNA-Stücken zu fixieren, wodurch der interessante Teil des Materials bestimmt wird. Darüber hinaus umfasst dieses Stadium das Stadium des Tandemschattens, durch das das DNA-Molekül verstärkt wird.

Die dritte Stufe wird als Produktion bezeichnet, was die Bildung mehrerer DNA-Kopien bedeutet. Die Produktion ist ein wichtiger Schritt in der PCR, da sie enorme Mengen an DNA erhalten kann, die für eine spätere Analyse ausreichen.

Was ist eine PCR-Analyse und wie wird sie durchgeführt?

Die PCR-Analyse wird in mehreren Stufen durchgeführt:

1. Denaturierung: Zu Beginn der Reaktion wird die Probe mit Reagenzien gemischt, die die Doppelhelix der DNA zerstören und dadurch die beiden Ketten voneinander trennen. Dieser Schritt ermöglicht es Ihnen, den Zugang zum zielgenetischen Material freizugeben.
2. Ausglühen: Nach der Denaturierung bilden Reagenzien, Primer genannt, komplementäre Paare mit abgerissenen DNA-Ketten. Dies ermöglicht es den Primern, mit dem gesuchten genetischen Material in Kontakt zu treten und es auf eine weitere Zunahme vorzubereiten.
3. Dehnung und Synthese: Dann wird mit Hilfe eines speziellen Enzyms - einer thermostabilen DNA-Polymerase - die Grundierung verlängert und eine neue DNA-Kette, die die gewünschte Komplementärkette enthält, synthetisiert.
4. Wiederholungszyklen: Um eine große Anzahl von Kopien zu erreichen, wird der Dehnungs- und Syntheseprozess mehrmals wiederholt (normalerweise zwischen 20 und 40 Zyklen), wobei jedes Mal die Menge des zielgenetischen Materials erhöht wird.

Nach Abschluss der PCR-Analyse kann das resultierende genetische Material für weitere Untersuchungen wie die genetische Sequenzierung oder die Bestimmung des Vorhandenseins bestimmter Mutationen verwendet werden.

Zweck und Funktionsprinzip

Das Funktionsprinzip der PCR-Analyse basiert auf der schnellen und zyklischen Verstärkung der Ziel-DNA oder RNA unter Verwendung des DNA-Enzyms Polymerase. Die Analyse wird in drei Phasen durchgeführt: Denaturierung, Glühen (Anprobieren) von Grundierungen und Elongation.

In der ersten Stufe findet eine Denaturierung statt, bei der die Zwei-Bit-Struktur der DNA in zwei Ein-Bit-Moleküle unterteilt ist. Dies wird durch Erhitzen einer DNA-Probe auf eine hohe Temperatur im Thermocycle erreicht. Als Ergebnis dieses Schrittes wird eine einliniige DNA-Matrix erhalten.

In der zweiten Stufe werden Primer geglüht oder anprobiert, bei denen es sich um kurze Nukleotidsequenzen handelt, die spezifisch an die gewünschte DNA- oder RNA-Sequenz binden. Die Primer werden an der DNA-Matrix befestigt und bilden eine «gespielte» Struktur.

Im dritten Schritt findet eine Elongation statt, bei der sich das DNA-Enzym der Polymerase an die Primer anschließt und die Replikation eines neuen DNA-Strands synthetisiert. Als Ergebnis der Elongation wird eine zweischneidige Kopie der gewünschten DNA- oder RNA-Sequenz gebildet.